The SREBP (Sterol Regulatory Element-Binding Protein) pathway: a regulatory bridge between carotenogenesis and sterol biosynthesis in the carotenogenic yeast Xanthophyllomyces dendrorhous

Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that naturally produces the red-orange carotenoid astaxanthin, which has remarkable antioxidant properties. The biosynthesis of carotenoids and sterols share some common elements that have been studied in X. dendrorhous. For example, their synthesis requires metabolites derived from the mevalonate pathway and in both specific pathways, cytochrome P450 enzymes are involved that share a single cytochrome P450 reductase, CrtR, which is essential for astaxanthin biosynthesis, but is replaceable for ergosterol biosynthesis. Research on the regulation of carotenoid biosynthesis is still limited in X. dendrorhous; however, it is known that the Sterol Regulatory Element-Binding Protein (SREBP) pathway, which is a conserved regulatory pathway involved in the control of lipid metabolism, also regulates carotenoid production in X. dendrorhous. This review addresses the similarities and differences that have been observed between mammal and fungal SREBP pathways and what it is known about this pathway regarding the regulation of the production of carotenoids and sterols in X. dendrorhous.

Genomic organization of the structural genes controlling the astaxanthin biosynthesis pathway of Xanthophyllomyces dendrorhous

The cloning and nucleotide sequence of the genes (idi, crtE, crtYB, crtl and crtS) controlling the astaxanthin biosynthesis pathway of the wild-type ATCC 24230 strain of Xanthophyllomyces dendrorhous in their genomic and cDNA version were obtained. The idi, crtE, crtYB, crtl and crtS genes were cloned, as fragments of 10.9, 11.5, 15.8, 5.9 and 4 kb respectively. The nucleotide sequence data analysis indicates that the idi, crtE, crtYB, crtl and crtS genes have 4, 8,4, 11, and 17 introns and 5, 9, 5, 12 and 18 exons respectively. In addition, a highly efficient site-directed mutagenesis system was developed by transformation by integration, followed by mitotic recombination (the double recombinant method). Heterozygote idi (idi+ / idi-::hph), crtE (crtE+ / crtE -::hph), crtYB (crtYB + / crtYB -::hph), crtI (crtI+ / crtI-::hph) and crtS (crtS +/crtS -::hph) and homozygote mutants crtYB (crtYB -::hph/crtYB -::hph), crtI (crtI -::hph/crtI -::hph) and crtS (crtS -::hph / crtS -::hph) were constructed. All the heterozygote mutants have a pale phenotype and produce less carotenoids than the wild-type strain. The genetic analysis of the crtYB, crtl and crtS loci in the wild-type, heterozygote, and homozygote give evidence of the diploid constitution of ATCC 24230 strains. In addition, the cloning of a truncated form of the crtYB that lacks 153 amino acids of the N-terminal region derived from alternatively spliced mRNA was obtained. Their heterologous expression in Escherichia coli carrying the carotenogenic cluster of Erwinia uredovora result in trans-complementation and give evidence of its functionality in this bacterium, maintaining its phytoene synthase activity but not the lycopene cyclase activity.

Occurrence of killer yeast strains in industrial and clinical yeast isolates

The secretion of proteinaceous toxins is a widespread characteristic in environmental and laboratory yeast isolates, a phenomenon called "killer system". The killer phenotype (K+) can be encoded by extrachromosomal genetic elements (EGEs) as double stranded DNA or RNA molecules (dsDNA, dsRNA) or in nuclear genes. The spectrum of action and the activity of killer toxins are influenced by temperature, salinity and pH of media. In the present work we determined the existence of K+ in a collection of S. cerevisiae and P. anómala yeasts isolated from environmental, industrial and clinical sources. The assays were performed in strains belonging to three yeast genera used as sensitive cells and under a wide range of pH and temperatures. Approximately 51 percent of isolates tested showed toxicity against at least one sensitive yeast strain under the conditions tested. The K+ P. anómala isolates showed a wide spectrum of action and two of them had toxic activity against strains of the three yeast genera assayed, including C. albicans strains. In all S. cerevisiae K+ isolates an extrachromosomal dsRNA molecule (4.2 Kb) was observed, contrary to P. anómala K+ isolates, which do not possess any EGEs. The K+ phenotype is produced by an exported protein factor and the kinetics of killer activity production was similar in all isolates with high activity in the log phase of growth, decaying in the stationary phase.

Caracterización de una levadura emergente / Characterization of an emerging yeast

Las infecciones fúngicas han aumentado en el último tiempo, entre ellas las causadas por hongos levaduriformes. Siendo descritas actualmente como levaduras emergentes, han sido confundidas frecuentemente con especies del género Candida, presentando diferencias sutiles en las características morfofisiológicas, además de presentar patrones de susceptibilidad diferentes al género Candida. El presente trabajo fue propuesto para caracterizar morfofisiológica y molecularmente a una de ellas.

Study of the expression of carotenoid biosynthesis genes in wild-type and deregulated strains of Xanthophyllomyces dendrorhous (Ex: Phaffia rhodozyma)

The expression, at the mRNA level, of carotenoid biosynthetic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous was studied by RT-PCR. The experimental conditions for the RT-PCR assay were standardized to quantify the relative transcript levels of idi, crtE, crtYB and crtI genes. This work attempted to correlate astaxanthin production with the transcript levels of carotenogenic genes in a wild-type strain (UCD 67-385) and two overproducer deregulated strains (atxS1 and atxS2). At 3 day cultures, the wild-type strain contained higher transcript levels from the crtE and crtYB genes on minimal medium than on rich medium. Similarly, carotenoid production was higher on minimal medium than on rich medium. However, carotenoid production in the atxS1 and atxS2 strains was not correlated with the transcript level of carotenogenic genes under the same experimental conditions. This result suggests that there is not a linear relationship between carotenogenic transcript levels and carotenoid biosynthesis.

Estudio genético molecular de levaduras de diversos ambientes / Molecular genetic study of yeasts from different environments

Se describe la presencia de polimorfísmo genético en levaduras nativas aisladas de diferentes ambientes, tales como: agua de mar, suelos forestales con poca intervención antrópica, suelos de viñedos, otros ambientes naturales y desde pacientes con fungemia severa. Se detectó la presencia de elementos genéticos extracromosómicos en cuatro cepas diferentes de levaduras. El análisis de amplificación de una región ITS utilizando partidores específicos para el ITS2 (partidores ITS3 e ITS4), permite determinar una banda de amplificación de rDNA que varia de tamaño entre 450 y 560 pb. dependiendo del género de levadura analizada. En una cepa de Cryptococcus terreus se observó la presencia de tres bandas de amplificación ITS que sugieren una organización compleja de los genes de rDNA en esa cepa. Finalmente el análisis del cariotipo electroforético de cepas ambientales y clínicas de Pichia anomala mostró un marcado polimorfísmo cromosómico en esta levadura emergente.

Primer caso de queratitis fúngica en Chile debido a alternaria alternata / Fungical keratitis by alternaria alternata, first report in Chile

Un caso de queratitis fúngica debido a alternaria alternata es reportado. Este es el primer caso informado en Chile. Hifas fúngicas fueron detectadas en el raspado corneal, y cultivos fueron positivos a este hongo. El paciente fue, presumiblemente, curado después de tratamiento con Anfotericina-B e Itraconazol. Queratitis causadas por hongos filamentosos, del tipo especies de Fusarium, Aspergillus, Acremonium y Curvularia, son relativamente frecuentes, usualmente inducidos por trauma del tipo vegetales, metales y lentes de contacto. Nosotros reportamos un caso de queratitis humana debido a Alternaria alternata, posterior a traumatismo por un vegetal

Aislamiento de genes carotenogénesis de xanthophyllomyces dendrorhous (ex. phaffia rhodozyma) mediante PCR / Isolation of carotenogenesis genes of xanthophyllomyces dendrohous (ex. phaffia rhodozyma) through PCR

Xanthophyllomyces dendrorhous (ex.phaffia rhodozyma) es una levadura basidiomicetica carotenogénica, en la cual aspectos importantes de su biología como la organización general de su genoma, número de cromosomas y nivel de ploidia aún no son completamente entendidos. En atención a esto, se han orientado esfuerzos en estudios moleculares con el objetivo de aumentar el conocimiento de su genética. En el presente trabajo, se describe un eficiente procedimiento para seleccionar y clonar genes a partir de una genoteca de DNA genómico de x. dendrorhous mediante la amplificación de DNA por PCR, utilizándo parejas de partidores específicos para el gen crtl. Adicionalmente, se describe la síntesis de cDNA a partir de RNA total de la levadura mediante transcripción reversa acoplada a amplificación de DNA (rt-pcr)

Análisis de la sección 8 del cromosoma x de drosophila melanogaster mediante el uso de clones yac de saccharomyces cerevisiae / Analysis of section 8 of x chromosome from drosophila melanogaster by use of yac clones in saccharomyces cerevisiae

En drosophila melanogaster, los genes estructurales que codifican para hexoquinasas A y B, se ubican estrechamente ligados en el cromosoma I (x). Estos loci corresponden a la región citológica 8D4.EI en el mapa citogenético de dicho cromosoma. Con el objetivo de determinar la ubicación exacta de los loci para hexoquinasas A y B se realizó un análisis molecular, mediante el uso de cromosomas artificiales de levadura, que contienen DNA de la sección 8 del cromosoma x. Para tal efecto, se aisló DNA cromosómico intacto de siete clones YAC de s. cerevisiae que cubren dicha región. El DNA fue resuelto mediante electroforesis de campo pulsado y analizado por hibridación con DNA del plásmido pB322 y con un fragmento de DNA de 0, 67 Kb de d. melanogaster, amplificado por PCR con partidores heterólogos específicos para hexoquinasas. Los resultados de estos experimentos permitieron concluir que, la sonda homóloga es capaz de hibridar con el YAC II, lo cual coincide con la cobertura de este clon en la región citológica esperada

Formación y regeneración de protoplastos de phaffia rhodozyma / Formation and regeneration of phaffia rhodozyma protoplasts

En este trabajo se describe la preparación y regeneración de protoplastos a partir de cultivos frescos de la levadura carotenogénica phaffia rhodozyma, en forma eficiente y con un alto grado de rendimiento en la sobrevida de las células tratadas. Para ello se han realizado una serie de experimentos para formar protoplastos de p.rhodozyma, utilizando tres cepas silvestres y cinco cepas afectadas en carotenogénesis. Se probó las enzimas bioglucanasa, biocelulasa, bioxilanasa, glucoronidasa, zimoliasa 100T, lisozima y novozima 234, encontrándose que novozima 234, es la que tiene mayor eficiencia. En las cepas silvestres UCD 67-210 y UCD 67-385 y las cinco cepas de color, se logra un 100 porciento de protoplastos entre 60 a 90 minutos de tratamiento con novozima a 37ºC. Sin embargo, no fue posible formar protoplastos en ninguna de las condiciones estudiadas con las cepas silvestres UCD 67-383. Tales resultados pueden ser devidos a diferencias en la pared celular entre dichas cepas. Además, se ha observado que la incubación a 37ºC reduce notablemente la sobrevida de las células tratadas. Para la formación y regeneración de protoplastos se utilizó una serie de condiciones, encontrando que un sorbitol 0.2 M la destrucción de las células es menor que a concentraciones de sorbitol 0.8 y 1 M. Sin embargo, el medio más adecuado para la formación y regeneración de los protoplastos debe contener KC1 0.8 M como agente osmolar, manteniendo la isotonía del medio y logrando que la destrucción celular sea menor

Presencia de plasmidos de DNA de doble hebra en phaffia rhodozyma / Presence of double stranded plasmid DNA in phaffia rhodozyma

El análisis mediante electroforesis en gel de agarosa, de los ácidos nucleicos de tres cepas silvestres de phaffia rhodozyma, permitió determinar la presencia de elementos genéticos extracromosómicos de DNA de doble hebra en una de ellas, la cepa UCD 67-210. Esta cepa es portadora de al menos 6 bandas de DNA cromosómico y cuyos tamaños moleculares corresponden a 6.5, 5.9, 5.0, 4.4, 3,2 y 2.5 kb. Con el objetivo de determinar el tipo de ácido nucleico que constituye estos elementos, se estudió su comportamiento frente a diferentes nucleasas. El tratamiento con ribonucleasa A, ya sea en alta o baja fuerza iónica, no tiene efecto sobre las bandas electroforéticas, así como el tratamiento con nucleasa SI. Por el contrario, el tratamiento con desoxiribonucleasa pancreática conduce a una degradación completa de las bandas y del DNA cromosómico. Estos resultados sugieren que la naturaleza química de los plásmidos corresponde a DNA de doble hebra. Por otra parte, la visualización de los plásmidos en gel de agarosa, depende de la utilización de proteinasa K y SDS en el procedimiento de purificación de los plásmidos y en las condiciones de corrida electroférica, sugiriendo la presencia de un complejo DNA plásmidial-proteína en cada uno de estos elementos. Finalmente, el análisis mediante enzimas de restricción de dos de estos plásmidos, sugiere que estos elementos no están relacionados

Efectos de ketoconazol, clotrimazol, nistatina y cicloheximida sobre el crecimiento de phaffia rhodozyma / Effects of ketoconazole, clotrymazole, nystatin and cycloheximide on the growth of phaffia rhodozyma

Debido a la importancia biotecnológica en la producción de pigmentos, se determinaron los niveles de sensibilidad a antifúngicos de 3 cepas de Phaffia rhodozyma, con la finalidad de obtener mutantes resistentes, característica usada como marcador en el análisis genético de diferentes microorganismos. El desarrollo de las tres cepas, fue inhibido por ketoconazol, clotrimazol, nistatina y cicloheximida respectivamente. La cepa UCD 67-210 resultó ser la más sensible al ketoconazol, siendo inhibida por concentraciones de 5 ug/ml de dicho compuesto. Para las cepas UCD 67-383 y UCD 67-385 se requieren concentraciones de 20 ug/ml. El cotrimazol, inhibió el crecimiento de las cepas UCD 67-210 y UCD 76-385, a una concentración de 10 ug/ml y a la cepa UCD 67-383 a 20 ug/ml. La nistatina inhibe el crecimiento de las cepas UCD 67-383 y UCD 67-385 a una concentración de 3 ug/ml y a la cepa UCD 67-210 a 5 ug/ml. La cicloheximida impide el desarrollo de las cepas UCD 67-210 y UCD 67-385 a una concentración de 2 ug/ml. La cepa UCD 67-383 resultó ser la más resistente, requiriéndose concentraciones sobre 6 ug/ml para inhibir su crecimiento

Análisis del genoma de pycnoporus cinnabarinus mediante electroforesis de campo pulsado / Pycnoporus cinnabarinus genome analysis by pulse field gel electrophoresis

En el presente trabajo se describe la separación óptima de moleculas de DNA cromosómico intacto del hongo filamentoso Pycnoporus cinnabarinus, mediante electroforesis de campo pulsado usando un sistema de contorno de campo eléctrico homogéneo (CHEF), con un electrodo hexagonal. Se estudió una serie de condiciones experimentales en las cuales se hizo variar la duración del intervalo de tiempo en cada dirección del campo y el tiempo total de la corrida. De esta manera fué posible separar el DNA cromosómico de P. cinnabarinus en cuatro bandas que, dependiendo de las condiciones electroforesis, pueden ser resueltas por lo menos en siete bandas. Utilizando los patrones de migración del DNA cromosómico de Saccharomyces cerevisiae y Schawanniomyces occidentalis como estándar, estimamos que los tamaños moleculares del DNA cromosómicos de P.cinnabarinus oscilan entre 1.9 y 2.5 megabases (mb)

Construcción de vectores de integración de saccharomyces cerevisiae y su aplicación en el genoma de neurospora crassa / Construction of integrating vectors of saccharomyces cerevisiae and their application in the genome of neurospora crassa

El presente trabajo describe la construcción de tres vectores de integración y un vector de replicación autonoma de Saccharomyces cerevisiae. Dichos vectores se caracterizan por poseer el gen LEU2 de levadura y los genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina que sirven como marcadores geneticos en Escherichia coli. Por otro lado, el gen LEU2 puede ser utilizado en la selección de transformantes de Sacharomyces cerevisiae. Los plásmidos VCp1, VCp2,1, VCp2,2 y VCp2,3 transforman a la levadura en baja frecuencia (aproximadamente 10 transformantes/ug de DNA) y se comportan como vectores de integración verdaderos. Los plásmidos VCp1 y VCp2,1 fueron utilizados para la construcción de dos genotecas de Neurospora crassa a fin de aislar secuencias de replicación autónoma de Neurospora en levadura. A partir de la genoteca en VCp1, se pudo aislar un plásmido portador de un inserto que corresponde a un fragmento de 3,5 kb de DNA del hongo

Acción antifungica de clorpromacina, ketoconazol y cicloheximida sobre dos cepas de Pycnoporus cinnabarinus (Jacq. ex Fr.) Karst / Antifungic action chlorpromacine, ketoconazole and cycloheximide on two Pycnoporus cinnabarinus (Jacq. ex Fr.) Karst strains

El desarrollo de dos cepas de Pycnoporus cinnabarinus (Jacq. ex Fr.) Karts, fue inhibido durante 72 horas al agregar al medio de cultivo clorpromacina, ketoconazol o cicloheximida respectivamente. La cepa Pc 58 fue inhibida por 33 ug/ml de clorpromacina y la cepa Pc470.6 por 40 ug/ml. Cicloheximida inhibió el crecimiento de la cepa Pc58 a una concentración de 3 ug/ml y a la cepa Pc470.6 a 5 ug/ml. El agente más eficaz para inhibir el crecimiento de estas cepas de P. cinnabarinus fue el Ketoconazol, que actuó a concentraciones menores de 0,5 ug/ml en la cepa Pc58 y a 0,9 ug/ml en la cepa Pc470.6